本試劑盒只能用于科學(xué)研究，不得用于醫(yī)學(xué)診斷

雞可溶性壞死因子-1(sTNF-1)ELISA試劑盒

使用說明書

檢測原理

試劑盒采用雙一步夾心法酶聯(lián)吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被白蛋白（ALB）的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、品、HRP標(biāo)記的檢測，經(jīng)過溫育并洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的白蛋白（ALB）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。

免責(zé)聲明：試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或生物體實(shí)驗(yàn)，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)， 本公司概不負(fù)責(zé)。嚴(yán)格按照說明書操作，不同批號不可交換使用，實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。

間接ELISA：本法主要用于檢測。（DVH）的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下。⑴ 材料① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液；② DVH包被抗原、酶標(biāo)抗、陰性及陽性DVH參考；待檢鴨；③ ELISA檢測儀、加樣器、聚微量板。⑵ 步驟① 加抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干② 加待檢 → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干③ 加酶標(biāo) → 37℃ 2小時(shí)，洗滌三次、拋干④ 加底物液　→ 37℃ 30分鐘，加終止液⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值，并計(jì)算出P/N比值。⑶ 結(jié)果判定　已知陽性與已知陰性的比值（P/N）≥2.1，而且已知陽性的OD值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢與已知陰性的比值（P/N）≥2.1，而且待檢的OD值≥0.4，則判為陽性，否則判為陰性。

樣品收集、處理及保存

1.  ：使用不含熱原和內(nèi)的試管，操作中避免任何細(xì)胞，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2.  ：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。

3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4.  組織勻漿：將組織加入適量鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。

5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

自備物品

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

ELISA （Enzyme-Linkedimmunosorbent assay）的基礎(chǔ)是抗原或的固相化及抗原或的酶標(biāo)記。這一的基本原理是：①使抗原或結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其活性。②使抗原或與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或，這種酶標(biāo)抗原或既保留其活性，又保留酶的活力。在測定時(shí)，把待測樣本（測定其中的或抗原）和酶標(biāo)抗原或按不同的步驟與固相載體表面的抗原或起反應(yīng)。用洗滌的使固相載體上形成的抗原復(fù)合物與其他分開結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢的量直接相關(guān)，所以可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺定性或定量分析。由于酶的催化速率很高，所以可地放大反應(yīng)效果，從而使測定達(dá)到很高的度。

操作注意事項(xiàng)

1.  試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。

2.  實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

3.  濃度為0的S0號品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍，終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度。

4.  嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。

5.  所有組分使用前充分搖勻。

試劑的

 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。

洗板

1.  手工洗板：甩盡孔內(nèi)，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。

2.  自動(dòng)洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置品孔和樣本孔，品孔各加不同濃度的品50μL；

3.  樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果判斷

 繪制曲線：在Excel工作表中，以品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

操作步驟：1.從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。2. 設(shè)置品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；品孔各加不同濃度的品 50μL；3. 待測樣本孔先加待測樣本 10μL，再加樣本稀釋液 40μL；4. 隨后品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測 50μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。5. 棄去，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗 板 5 次（也可用洗板機(jī)洗板）。6. 所有孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃避光孵育 15min。7. 所有孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。

試劑盒性能

1.  準(zhǔn)確性：品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2.  靈敏度檢測濃度小于1.0 mg/mL。

3.  特：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.  重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏：2-8℃，避光防潮保存。

6.  有效期：6個(gè)月

免責(zé)聲明

1.   試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或人體實(shí)驗(yàn)，否則所產(chǎn)生的一切后果，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)，本公司概不負(fù)責(zé)。

2.   嚴(yán)格按照說明書操作，實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)。